Réactivation du type d’herpèsvirus humain dans le syndrome d’insuffisance d’organes multiples

Dans cette étude, nous avons cherché à déterminer l’incidence de la réactivation du HHV et du CMV au cours du syndrome de défaillance multiviscérale MOFS et à évaluer les effets potentiels de la réplication virale sur les deux types de cytokinovirus informations. la morbidité et la mortalité associées à MOFS La réactivation virale a été évaluée en utilisant une réaction de polymérisation en chaîne spécifique. Analyse PCR des échantillons de sérum obtenus chez des patients consécutifs avec MOFS le groupe MOFS et chez des patients appariés selon le sexe et l’âge avec & lt; défaillances d’organes groupe témoin En outre, la réplication HHV a été évaluée chez les donneurs de sang dans le groupe normal. L’incidence de la réplication HHV était plus élevée dans le groupe MOFS que dans les groupes témoins et normaux [%] vs [%] de et [% ] de, respectivement; P & lt; , avec apparemment aucune influence sur les taux de morbidité et de mortalité En revanche, la réactivation du CMV a été retrouvée chez un seul patient Des études supplémentaires sont nécessaires pour évaluer la pathogenèse de la réplication du HHV chez les patients gravement malades

L’herpèsvirus humain de type HHV- est un β-herpesvirus principalement lymphotrope qui est étroitement apparenté au cytomégalovirus CMV L’infection primaire au HHV, qui survient dans la petite enfance , est étiologiquement liée à l’exanthem subitum roséole et est considérée comme cause majeure de la maladie fébrile aiguë bénigne chez les jeunes enfants En conséquence, la prévalence moyenne des anticorps dans la population générale a été signalé être dans la gamme de% -%, en fonction de l’âge de l’échantillon de population Chez les sujets sains, le virus persiste principalement dans les cellules mononucléées du sang périphérique Chez les sujets immunodéprimés, la réactivation du HHV- peut être associée à une pneumopathie interstitielle, une moelle osseuse, une encéphalite, une hépatite et une maladie fébrile. au développement d’un dysfonctionnement organique d’organe secondaire à une agression aiguë, quelle que soit sa nature Cette entité clinique est caractérisée par une libération excessive de cytokines pro-inflammatoires, comme le TNF-α Des taux accrus de ces cytokines circulantes en réponse à une septicémie sévère peuvent favoriser la réactivation du CMV Parce que les génomes du HHV- et du CMV sont semblables et que les deux virus peuvent rester latents dans les monocytes après l’infection primaire, nous avons émis l’hypothèse que des niveaux accrus de cytokine associés au MOFS pourraient favoriser la réactivation du HHV et du CMV, ce qui pourrait interagir avec la physiopathologie du MOFS. Dans cette étude prospective, nous avons cherché à évaluer HHV et CMV chez les patients avec MOFS; évaluer l’influence de cette réactivation sur la morbidité et la mortalité; et identifier les variables cliniques potentielles pouvant être prédictives de la réplication virale chez ces patients

Patients et méthodes

Utilisation d’un test d’immunofluorescence avec des cellules HSB infectées par la souche HHV-GS Chaque échantillon de sérum dilué a été testé à partir de: Détermination de l’IgM nécessaire à l’élimination initiale du facteur rhumatoïde en utilisant le facteur rhumatoïde Absorbe Behring-Wercke utilisation de fragments Fab ‘humains biotinylés spécifiques, suivis d’un conjugué streptavidine-fluorescéine Immunotech Tous les échantillons de sérum ont été analysés en double, et un échantillon de sérum standard de titre connu a été inclus dans chaque échantillon de sérum présentant une fluorescence cytoplasmique à une dilution de ⩾ : ont été testés positifs pour les cellules HSB anti-HHV non infectées, qui ont été testés à une dilution de:, ont été utilisés comme témoins pour la coloration non spécifique de l’antigène du CMV. Un échantillon sanguin a été prélevé dans un tube héparinisé pour réaliser le test anti- a été traitée dans h Détection de CMV pp protéine de la matrice inférieure dans les leucocytes du sang périphérique a été réalisée en utilisant le kit CMV Brite Biotest Di agnostiques En bref, les leucocytes du sang périphérique ont été séparés au moyen d’une sédimentation au dextrane, et les cellules ont été appliquées à chacune des lames au moyen d’une cytocentrifugation Cytospin; Shandon Scientific Les cellules ont été fixées dans du paraformaldehyde, rendues perméables avec Nonidet P-Sigma, colorées avec les anticorps CMV pp C et C, et examinées sous microscope à épifluorescence. Les neutrophiles CMV-positifs ont été comptésPCR pour la détection de l’ADN HHV- La réactivation de HHV- a été évaluée par détection de l’ADN HHV dans les échantillons sériques des sujets par PCR L’extraction de l’ADN des échantillons sériques a été réalisée par l’utilisation d’un kit sanguin QIAamp. Les cellules Qiagen HSB infectées par la souche GS de HHV ainsi que les cellules non infectées ont également été traitées. Un criblage préliminaire d’échantillons contre des inhibiteurs de PCR connus a été effectué par amplification du locus HLA de l’antigène leucocytaire humain DQA après addition de ng d’ADN humain extrait de cellules HSB non infectées dans chaque échantillon. puis réalisée sur μL d’extrait et réalisée avec les amorces H ‘-AAGCTTGCACAATGCCAAAAAACAG-‘ et H ‘-CTCGAGTATGCCGAGACCCCTAATC-‘, comme décrit par Cone et al , pour amplifier une séquence cible -bp localisée sur un cadre de lecture ouvert de HHV- Ces amorces sont spécifiques de HHV- et n’amplifient aucun autre herpèsvirus humain connu. La procédure consistait en cycles à ° C pour s, ° C pour s. , et ° C pour les s qui ont été précédés d’une étape de dénaturation initiale effectuée à ° C pour min et ont été suivis d’une étape d’élongation à ° C pour les produits min Amplified ont été hybridés en utilisant la sonde ADN R marquée à la digoxigénine ‘-CCGTCTTACTGTATCCGAAACAACTGTCTG – ‘à ° C puis révélé par le conjugué de la phosphatase alcaline antidigoxigénine et son substrat chimioluminescent chloro-substitué Boehringer-Mannheim Cette méthode PCR a la capacité de détecter aussi peu que des copies du génome HHV Chaque lot PCR a été répété au moins une fois, et nous avons toujours inclus des contrôles négatifs un avec et un sans ADN et un contrôle positif Les contrôles ont été analysés en parallèle à partir de l’étape d’extraction Toutes les expériences ont été effectuées au moins en double; Aucun échantillon discordant n’a été trouvé Les résultats de PCR négatifs ont été acceptés seulement lorsque le locus DQA a pu être amplifié pour cet échantillonPCR pour la détection d’ADN CMV La réactivation CMV a également été montrée par détection d’ADN viral dans des échantillons de sérum d’un patient. l’extrait d’ADN utilisé pour l’amplification de HHV, en utilisant la même méthode Ceci a permis le marquage direct de produits de PCR avec de la digoxigénine pendant le processus d’amplification PCR ELISA Dig; Boehringer-Mannheim et détection subséquente par un essai sur plaque de microtitrage à base d’hybridation PCR ELISA Dig detection; Amorce de Boehringer-Mannheim MCP / ‘-CAGACCACCATTATGGTCACC-‘ et MCP / ‘-CTCTGCAAGATGTTGCTTCG-‘ a amplifié une séquence cible -bp localisée sur le gène de la protéine de capside majeure du CMV La procédure a consisté en cycles à ° C pour s, ° C pour s, et ° C pour min qui ont été précédés d’une étape de dénaturation initiale faite à ° C pour min et ont été suivis par une étape d’élongation faite à ° C pour min Hybridation a été réalisée avec une sonde spécifique ‘-AAGCTGTGAATCAAGCCGC-‘Analyse statistique la fréquence de la réactivation du HHV et du CMV, sur la base de la présence d’ADN viral et d’antigénémie du CMV dans les échantillons sériques, a été comparée pour tous les groupes MOFS, témoins et groupes normaux en utilisant le test tit des moyennes géométriques des anti-HHV – Les IgG ont également été comparées pour les groupes, au moyen d’une analyse de variance. Les valeurs cliniques et biologiques ont été comparées dans le groupe MOFS pour les patients avec un résultat PCR positif et sans résultat PCR négatif. Réactivation HHV – Variables continues w comparés par l’utilisation du test U non-paramétrique de Mann-Whitney et les variables qualitatives ont été comparées par l’utilisation du test,, avec correction de continuité lorsque P ⩽ approprié a été considéré comme statistiquement significatif. Les résultats sont exprimés en moyenne ± écart-type

Résultats

Au cours de la période d’étude, les patients ont été admis à l’unité de soins intensifs et ont développé des MOFS. Parmi eux, les patients avaient soit un diagnostic de SIDA n = ou avaient reçu une greffe d’organe n =, et donc pas été inclus dans l’étude. Le groupe MOFS et les patients appariés selon l’âge et le sexe avec, au plus, une insuffisance organique ont été inclus dans le groupe de contrôle. Les patients ont été inclus dans l’étude après une moyenne ± ET de ± jours d’hospitalisation dans l’unité de soins intensifs. période, les donneurs de sang ont été inclus dans le groupe normal% d’hommes; âge moyen ± SD, ± années; Le nombre de dysfonctions organiques, le score APACHE II, le score SOFA et le taux de mortalité étaient significativement plus élevés chez les patients du groupe MOFS que chez les patients du groupe témoin. Les patients étaient principalement admis en unité de soins intensifs pour une maladie médicale aiguë dans les deux groupes La deuxième cause la plus fréquente d’hospitalisation était un cours post-chirurgical compliqué chez les patients avec MOFS et un traumatisme multisystémique chez les patients du groupe témoin. Les infections étaient deux fois plus fréquentes chez les patients du groupe MOFS. Les infections étaient similaires à celles observées chez les patients du groupe témoin. Données non présentées La proportion d’hôtes immunodéprimés était similaire entre les groupes et était liée au cancer n = et à la corticothérapie à long terme n =

Tableau View largeTélécharger slideCaractéristiques des patients atteints d’un syndrome de défaillance multiviscérale groupe MOFS ou sans groupe de contrôle MOFSTable View largeTélécharger slideCaractéristiques des patients présentant un syndrome de défaillance multiviscérale Groupe MOFS ou sans groupe de contrôle MOFSLa prévalence des anticorps anti-HHV-IgG était similaire dans les groupes Groupe MOFS,% dans le groupe témoin, et% dans le groupe normal; NS De même, aucune différence significative du titre moyen géométrique des anticorps anti-HHV-IgG n’a été observée dans les groupes du groupe MOFS, dans le groupe témoin et dans le groupe normal; NS Le résultat anti-HHV-IgM était positif uniquement chez les patients avec MOFS et chez les patients du groupe contrôle. Le génome de HHV- a été détecté chez% des patients du groupe MOFS. La fréquence d’un résultat PCR positif était significativement plus faible dans le contrôle groupe et dans le groupe normal [%] de et [%] de, respectivement; P & lt; La figure montre un exemple d’hybridation de l’amplification HHV avec des échantillons sériques positifs et négatifs Aucune inhibition de la PCR n’a été détectée dans les échantillons testés par amplification HLA. La réactivation du CMV, déterminée par le test antigénique, était négative chez tous les patients, tandis que CMV l’amplification était positive chez un seul patient chez lequel la réplication HHV était également retrouvée

Figure Vue largeDownload slideHybridation de type herpèsvirus HHV- produits de la réaction en chaîne de la polymérase Lane, marqueur de poids moléculaire de l’ADN IX – bp; Voie Boehringer-Mannheim, contrôle négatif Voies,,,,, et, échantillons positifs Voies,, et, échantillons négatifs Voie, contrôle positif; x, bp HHV- productFigure Afficher en grand formatDisque de glissementHybridation de type herpèsvirus HHV- produits de la réaction en chaîne de la polymérase Voie, marqueur de poids moléculaire de l’ADN IX – bp; Voie Boehringer-Mannheim, contrôle négatif Voies,,,,, et, échantillons positifs Voies,, et, échantillons négatifs Voie, contrôle positif; x, bp HHV- productLes caractéristiques des patients avec MOFS, selon la présence ou l’absence de réactivation HHV, sont résumées dans le tableau Aucune différence significative n’a été trouvée entre les patients avec une infection à HHV active et ceux sans réactivation virale, en termes d’âge, de sexe De même, le nombre et la nature des dysfonctions organiques, les scores APACHE II et les scores SOFA étaient comparables dans les deux sous-groupes de patients. La fréquence des infections bactériennes associées était similaire chez les patients avec MOFS et chez les patients du groupe contrôle [%] de vs [%] de; P =, ainsi que les caractéristiques de ces infections données non montrées La présence d’une cause d’immunosuppression n’était pas significativement liée à la réactivation de HHV- Chez les patients avec MOFS, tous les paramètres biologiques étudiés étaient similaires, indépendamment de la présence ou de l’absence de HHV- table de réactivation

Tableau View largeTélécharger slideCaractéristiques des patients présentant un syndrome de défaillance multiviscérale MOFS, selon la présence résultat PCR positif ou négatif résultat PCR négatif de type herpèsvirus HHV- réactivationTable Voir grandDownload slideCaractéristiques des patients présentant un syndrome de défaillance multiviscérale MOFS, selon la présence Résultat PCR positif ou absence de résultat PCR négatif de type herpèsvirus HHV-réactivation

Tableau View largeTélécharger slideClinique et biologique des patients présentant un syndrome de défaillance multiviscérale MOFS, selon la présence Résultat PCR positif ou négatif Résultat PCR négatif de type herpèsvirus HHV- réactivationTable Voir grandDownload slideCliniques cliniques et biologiques des patients présentant un syndrome de défaillance multiviscérale MOFS, selon à la présence résultat PCR positif ou absence résultat PCR négatif de type herpès virus réactivation HHV

Discussion

des sujets sains, parce que la réplication virale est étroitement contrôlée par leurs systèmes immunitaires compétents Par conséquent, dans la présente étude, l’analyse PCR a permis de détecter l’ADN viral dans les échantillons sériques de sujets normaux seulement. Cette divergence peut s’expliquer par la plus grande taille de la cohorte que nous avons étudiée et par le recrutement de sujets normaux qui étaient des donneurs de sang anonymes. et n’ont pas été spécifiquement dépistés pour les symptômes d’une infection virale en cours. En accord avec les résultats d’une étude précédente , la réplication active du HHV était plus fréquente chez les patients immunodéprimés, bien que la signification statistique n’ait pas été atteinte [%] ; P = Chez les patients immunocompétents, les effets du vieillissement sur la fonction du système immunitaire ont été pris en compte par l’appariement du sexe et de l’âge des patients inclus dans les groupes MOFS et témoins. L’incidence de la réplication HHV, reflétée par la détection virale libre. ADN dans les échantillons de sérum, était plus élevé chez les patients atteints de MOFS que chez les patients du groupe témoin% vs%; P & lt; De même, l’ADN HHV a été identifié plus fréquemment chez les patients du groupe témoin que chez les sujets normaux, bien que la signification statistique n’ait pas été atteinte [%] vs [%]; P = Bien qu’aucun paramètre étudié n’était individuellement prédictif de la présence d’une réplication HHV sous-jacente dans les données du groupe témoin non montrées, l’ADN viral a été détecté dans les échantillons de sérum des patients les plus gravement malades de ce groupe, comme le reflète une scores de sévérité Score APACHE II: ± vs ±, P =; Score SOFA: ± vs ±, P = Aucun facteur prédisant une infection sous-jacente active HHV n’a été trouvé. L’analyse de ces données suggère que l’incidence élevée de la réplication HHV chez les patients présentant une insuffisance organique peut être secondaire à l’intensité de la réponse inflammatoire A l’exception du patient, aucune réactivation du CMV n’a été détectée dans la présente étude. Cela suggère que la réplication du HHV peut être spécifiquement déclenchée par la réponse inflammatoire chez les patients avec MOFS Kutza et al identifié une réplication du CMV chez% des patients atteints de septicémie; Cette réplication est survenue quelques jours après le début de la septicémie. Bien que la réplication HHV ait été retrouvée dans le plasma d’une proportion similaire de patients gravement malades [%], nous n’avons pas confirmé la forte incidence de la réplication du CMV chez les patients MOFS. une divergence apparente peut être attribuée au dépistage précoce de la réplication virale après l’admission au délai moyen de réanimation (IC), ± jours, car une réactivation du CMV a été rapportée après un événement provocateur identifié par l’utilisation de la PCR et de la détection antigénique Les différences dans les études de population peuvent également avoir joué un rôle, car seul un% des patients a eu une infection bactérienne, alors que Kutza et al ont exclusivement étudié des patients avec une septicémie avérée.Aucune morbidité ou mortalité supplémentaire n’a été associée à la présence de sepsis. Tableau d’infection à HHV- lorsque les paramètres cliniques et biologiques utilisés pour évaluer la pathogénicité du HHV- chez les hôtes immunodéprimés [,,] et chez les ts ont été utilisés Il est important de noter que la présence de dysfonctions organiques peut être difficile à distinguer des critères objectifs utilisés pour le diagnostic de l’infection par le HHV En accord avec les résultats rapportés par Kutza et al , qui étudiés l’influence potentielle de la réactivation du CMV sur la morbidité des patients atteints de septicémie, il y avait seulement une tendance vers des valeurs moyennes plus élevées d’AST et d’ALT chez les patients avec un ADN HHV circulant. – tableau des infections Il est important que le taux de mortalité n’ait pas été influencé par la présence de la réplication du HHV chez les patients du groupe MOFS et dans les groupes témoins% vs% et% vs%, respectivement; P & gt; , comme indiqué précédemment pour l’infection par le CMV Notre étude présentait des limites substantielles Les concentrations plasmatiques de cytokines n’étaient pas mesurées pour évaluer quantitativement l’intensité de la réponse inflammatoire, et nous n’avons pas comparé les valeurs circulantes du TNF-α avec la présence ou l’absence. de la réplication du β-herpèsvirus Bien que l’incidence de la réactivation du HHV soit nettement plus élevée chez les patients atteints de MOFS, nous n’avons pu démontrer aucune influence de cette réplication virale sur la morbidité et la mortalité. des patients avec MOFS avec et sans réplication virale doivent être étudiés pour démontrer un% d’augmentation du taux de mortalité lorsque ce syndrome est associé à une infection sous-jacente active HHV Enfin, nous n’avons pas surveillé la réactivation CMV pendant le séjour en USI pour tenter de détecter réplication virale retardée

Conclusions

Cette étude confirme la faible incidence de la réplication HHV dans la population générale. En revanche, l’analyse de nos données indique que l’incidence de l’infection à HHV active est aussi élevée que% chez les patients qui subissent MOFS, et elle est nettement supérieure à les patients témoins admis en unité de soins intensifs, avec ou sans dysfonctionnement des organes, ont manifesté une réactivation spécifique car aucune réplication du CMV n’a été retrouvée et cette réactivation pourrait être facilitée par l’intensité de la réponse inflammatoire à une agression aiguë. D’autres études sont nécessaires pour déterminer si la réactivation du HHV influence le résultat des patients qui soutiennent MOFS et pour évaluer l’intérêt potentiel de la thérapie antivirale dans ce contexte clinique