Découverte du double PPAR α Agonistes / CB1 Ligands

Les récepteurs PPAR (peroxisome proliferator-activated receptors) appartiennent à la superfamille des récepteurs nucléaires impliqués dans la régulation du métabolisme du glucose et des lipides, ainsi que dans l’adipogenèse, l’alimentation et d’autres processus tels que l’inflammation et la neuroprotection. Par conséquent, ce sont des cibles intéressantes en chimie médicinale.1 Parmi les trois isoformes, PPAR α est une cible pertinente pour le développement pharmaceutique, l’oléoylethanolamide (OEA) étant son ligand endogène.2 PPAR α les agonistes (par exemple, le fénofibrate, le clofibrate) sont capables d’abaisser les triglycérides et d’élever les taux de lipoprotéines de haute densité. Les limites des fibrates actuellement approuvés sont leur faible sélectivité, leur faible affinité pour les récepteurs clonés humains et de rongeurs, et le fait qu’ils nécessitent des concentrations micromolaires élevées pour être efficaces. Les progrès récents dans ce domaine ont conduit à la découverte de la soi-disant deuxième génération de PPAR α d’autre part, les propriétés thérapeutiques des cannabinoïdes, y compris les dérivés d’origine végétale et les dérivés synthétiques, sont dues aux interactions avec les récepteurs aux cannabinoïdes CB1 et CB2. L’identification de ces récepteurs couplés aux protéines G4 responsables de nombreux processus biochimiques a conduit à la découverte de l’anandamide (AEA) et du 2-arachidonoyl glycérol (2-AG) comme ligands endogènes. Le système endocannabinoïde comprenant les endocannabinoïdes, les récepteurs aux cannabinoïdes et les protéines impliquée dans les mécanismes de régulation, y compris le transporteur de l’anandamide (ANT), l’amide hydrolase des acides gras (FAAH), et la monoacylglycérol lipase (MAGL), est une cible thérapeutique pertinente.5,5b Parmi les ligands synthétiques de ces récepteurs, l’antagoniste des récepteurs cannabinoïdes rimonabant s’est avéré efficace pour réduire le gain de poids et les lipides plasmatiques, bien que les effets secondaires l’ont interdit comme un médicament commercialisé.6PPAR sont des capteurs de niveaux d’acides gras. Il y a de plus en plus de preuves suggérant que les endocannabinoïdes ou des composés apparentés peuvent activer les PPAR. Un des ligands endogènes qui a une affinité nanomolaire pour le PPAR α le récepteur est OEA.7 La première étude qui a établi les interactions entre les cannabinoïdes et les PPARs a été publiée en 20028 dans laquelle l’endocannabinoïde 2-AG s’est avéré augmenter l’activité transcriptionnelle de PPAR &#x003b1 ;. Une autre signification vient du fait que les deux antagonistes des cannabinoïdes et PPAR α les agonistes peuvent être utiles en tant qu’agents thérapeutiques pour le traitement neuroprotecteur.9,9b Les cannabinoïdes (endogènes, phytoduits et synthétiques) ne se lient pas aux PPAR ou ne les activent pas dans la même mesure que les ligands PPAR synthétiques disponibles; par conséquent, ils peuvent fonctionner avec succès en tant qu’agonistes partiels des PPAR, réduisant les effets cancérogènes potentiels des agonistes des PPAR. Pour cette raison, les actions des cannabinoïdes dans les PPAR fourniraient un mécanisme alternatif pour les cannabinoïdes comme agents thérapeutiques. Il a été rapporté que la combinaison des cannabinoïdes avec d’autres composés (autres cannabinoïdes ou agonistes des PPAR) augmente leur potentiel thérapeutique. Par exemple, la combinaison de l’OEA (PPAR &#x003b1, agoniste) et du rimonabant (antagoniste CB1) a entraîné une suppression plus efficace de l’alimentation et une perte de poids accrue.10 Un autre exemple peut être trouvé dans la combinaison AEA (CB1) et GW7647 (PPAR &#x003b1, agoniste) entraînant des effets synergiques sur la réduction du comportement douloureux11. Nous avons précédemment rapporté des analogues de l’oléyléthanolamide comme PPAR α activateurs12 et dérivés d’antagonistes des cannabinoïdes contenant un motif 1,2,4-triazole.13 Nous rapportons maintenant des molécules incorporant des activités cannabinoïdes et PPAR dans une structure unique en utilisant la stratégie connue sous le nom de “ ligands multiples conçus ” (DML) 14. Par conséquent, nous avons décidé d’intégrer dans une molécule le pharmacophore des fibrates, le fénofibrate (PPAR) et un motif structural du rimonabant, un antagoniste CB1 / agoniste inverse (Figure ​ Figure 11). Figure 1 Structures de PPAR α -cannabinoïdes composés 1 – 4. La procédure utilisée dans notre laboratoire pour la synthèse des composés 1 – 4 est décrite dans le schéma 1. La synthèse a commencé avec le dérivé carboxylate 5 La formation d’amide médiée par le triméthylaluminium entre le composé 5 et le 3-aminophénol a été achevée en 3 minutes et 30 secondes à 125 ° C sous irradiation par micro-ondes donnant le composé 1. Cette méthodologie a évité l’hydrolyse traditionnelle des esters, l’activation acide pour obtenir en trois étapes le dérivé amide, outre la réduction du temps de réaction de 18 h à 3 min à l’aide d’un réacteur hyperfréquence. L’o-2-méthylpropionate a donné le composé cible 2. Une voie de synthèse similaire utilisant le 4-aminophénol au lieu du 3-aminophénol a été suivie pour la synthèse du dérivé phénolique 3 et du fibrate 4. Déprotonation du composé 3 et substitution nucléophile du dérivé bromo correspondant. a donné le composé 4.Schéma 1Synthèse des composés 1 – 4Les composés rapportés dans cette étude ont d’abord été évalués pour l’activité basale et induite par le ligand de PPAR α (Figure ​ (figure 22). Figure 2 L’activité induite par le ligand et par le ligand de PPAR &#x003b1 ;. Les colonnes représentent la moyenne d’au moins trois expériences et les barres indiquent les écarts-types. Les dosages de gènes rapporteur Luciferase ont été réalisés avec des extraits de cellules MCF-7 qui ont été transfectées de manière transitoire avec une construction de reporteur contenant quatre copies du RE humain de type CPTI DR1 (pour les PPAR) et la vecteurs d’expression indiqués pour PPAR &#x003b1 ;, RXR &#x003b1 ;, et NCoR (CoR) .Les cellules ont été traitées pendant 16 h avec une concentration de 10 μ M de différents composés: DMSO (solvant), la référence PPAR α l’agoniste WY14643, l’agoniste OEA PPAR α, et les composés 1 et 2 (Figure ​ (Figure2a) .2a) .La simulation MD de l’activité de la luciférase a été normalisée par rapport à l’activité de base de PPAR α &#x02013 ; RXR α – SRC1 en présence du solvant (DMSO). s sur la méthodologie ont déjà été publiés.12 Les composés 1 et 2 ont montré une activité agoniste au PPAR α récepteur à des concentrations nanomolaires élevées (Tableau 1). Ils étaient similaires en activité au fibrate WY14643, bien que le composé 2 soit légèrement plus puissant que le composé 1 mais 4 fois moins puissant que le ligand naturel oléyléthanolamide. Pour évaluer la stabilité des composés dans le test, deux expériences différentes modifiant le temps d’incubation ont été effectuées.Les cellules ont été traitées pendant 6 h avec une concentration en M de différents composés: DMSO (solvant), WY14643, OEA, et les composés 1 – 4 (Figure 2b) .2b). Ces résultats étaient en accord avec les précédents après 16 h d’incubation, et les dérivés de phénol 1 et 3 ont montré une activité agoniste au PPAR α récepteur à des concentrations nanomolaires élevées. Le composé 2 était le plus puissant de la série, tandis que son homologue 4 avec une substitution para au niveau du cycle benzénique était moins puissant avec une CE50 de 1,5 μ M.Table 1Pharmacological Properties of Compounds 1 – 4a Les composés ont été criblés pour l’activité des cannabinoïdes dans les essais de liaison au radioligand (tableau 2). Tous les composés ont déplacé la liaison de [3H] -CP55940 des récepteurs cannabinoïdes CB1 à des concentrations nanomolaires. Les valeurs de Ki des composés 1 et 2 étaient très similaires à l’agoniste de référence WIN 55, 212-2, alors que le composé 3 avec un Ki de 4,6 nM était plus puissant que le composé de référence rimonabant. Le composé 4 était le moins puissant de la série. L’échafaudage diarylpyrazole utilisé pour la conception des composés et le manque de puissance au niveau du récepteur cannabinoïde CB2 (données non présentées) sont habituellement associés à l’activité antagoniste sélective des récepteurs cannabinoïdes CB1. Tableau 2CB1 Récepteur AffinityaL’activité biologique des composés 2 (fibratelike) et 3 (p phénol) a été évalué en effectuant des expériences pharmacologiques dans le canal déférent de souris isolé (MVD) .16 Il s’agit d’un tissu couramment utilisé pour étudier et caractériser les effets des cannabinoïdes comme agonistes ou antagonistes.17 Le composé 2 a été choisi comme le meilleur composé double de la série et le composé 3 en raison de sa constante de liaison (4,6 nM) similaire à celle du rimonabant (7,3 nM). L’effet des composés a toujours été comparé à celui des médicaments de référence: l’arachidonyl-2-chloroéthylamide (ACEA) et l’AM251 comme agoniste et antagoniste sélectif des cannabinoïdes CB1, respectivement. Le MVD est une préparation de muscle nerveux lisse qui sert de dosage biologique in vitro fonctionnel quantitatif pour les agonistes des récepteurs aux cannabinoïdes. De plus, il est couramment utilisé comme bio-essai pour les antagonistes compétitifs sur les récepteurs cannabinoïdes surmontables et fournit également un moyen de distinguer les antagonistes neutres des cannabinoïdes des agonistes inverses. Le bioessai des agonistes des récepteurs aux cannabinoïdes repose sur la capacité de ces ligands à produire des diminutions de l’amplitude des contractions électriquement évoquées du canal déférent en agissant sur les récepteurs neuronaux préjonctionnels et en inhibant la libération des neurotransmetteurs contractiles tels que la noradrénaline et l’ATP. L’essai biologique d’antagonistes des récepteurs cannabinoïdes surmontables compétitifs examine la capacité de ces composés à produire des déplacements dextres dans les courbes de réponse de concentration logarithmique des agonistes des récepteurs cannabinoïdes dans les tissus stimulés électriquement18. Les données obtenues à partir des composés 2 et 3 aux concentrations testées ( 10 – 7 – 1,8 × 10 – 5 M) n’a révélé aucun effet sur l’enregistrement basal non stimulé ou sur la réponse contractile électriquement induite sur MVD (le% d’inhibition des contractions électriquement évoquées était < 10% et pas différent de celui induit par le véhicule), donc il peut être établi qu'ils manquent tous deux d'une activité intrinsèque (activation ou blocage) ou indirecte (induction ou inhibition de la libération des neurotransmetteurs) sur un grand nombre de récepteurs bien connus qui jouent un rôle dans le tonus basal ou sur la contraction induite électriquement dans ce tissu (adrénergique, purinergique, cannabinoïde, &#x003b4 ;, ​​&#x003bc ;, et κ Un résultat intéressant est que les composés 2 et 3 (aux deux concentrations testées 10 et 2 × 10 – 6 M) atténuent significativement l'inhibition induite par l'agoniste sélectif des récepteurs CB1 ACEA ( Figure ​ (Figure3) 3) comme cela s'est également produit avec le composé de référence AM251. Ces données suggèrent que les deux se comportent comme des antagonistes du récepteur CB1, le composé 2 étant aussi efficace que l'AM251, alors que le composé 3 est significativement plus efficace que l'AM251. De la forme de la courbe, il pourrait être suggéré qu'il se comporte comme un antagoniste compétitif, bien que plus de travail est nécessaire pour confirmer cette possibilité.Figure 3 L'activité fonctionnelle des composés 2 et 3 sur MVD. Les lignes montrent la moyenne% ± SEM (n = 6 – 8) inhibition de la contraction induite électriquement de la MVD induite par l'ajout de concentrations croissantes d'ACEA dans les tissus témoins ou ... En ce qui concerne les expériences d'antagonisme CB2, le composé 2 n'a pas modifié l'effet inhibiteur de l'agoniste sélectif du récepteur CB2 JWH-015 (données non présentées), de sorte qu'il pourrait être suggéré qu'il s'agit d'un antagoniste CB1 sélectif; d'autre part, le dérivé de phénol 3 était capable d'inhiber l'effet de JWH-015 (information de support), bien que cet effet était inférieur à celui observé sur le récepteur CB1, suggérant un effet CB1 relativement sélectif.Malgré l'affinité pour les deux récepteurs cannabinoïdes CB1 et PPAR α récepteurs, les composés n'ont pas montré d'activité en tant que suppresseurs d'alimentation in vivo chez des rats privés de nourriture lorsqu'ils sont administrés par voie intrapéritonéale (Informations complémentaires). L'absence d'effets aigus sur l'alimentation de ces dérivés acylés peut être attribuée à plusieurs raisons. Premièrement, le profil in vitro des composés peut ne pas se manifester in vivo en raison d'une pharmacocinétique médiocre. Deuxièmement, les composés peuvent affecter les mécanismes de signalisation non-CB1, non-PPAR α contrôlés qui contrôlent l'alimentation. Par exemple, OEA est un suppresseur d'alimentation qui agit non seulement au PPAR α En troisième lieu, l'absence d'effets aigus n'exclut pas l'induction potentielle des changements de dépense énergétique lorsque ces composés sont administrés de façon chronique. Tous ces aspects seront abordés dans de futures études. En résumé, nous avons préparé et évalué quatre composés, dont trois ont montré une affinité nanomolaire à la fois pour le PPAR α et les récepteurs CB1. La puissance moyenne-basse au PPAR α un récepteur similaire aux fibrates conduira probablement à un profil hypolipémiant et neuroprotecteur, tandis que la forte affinité pour le récepteur CB1 peut aider à moduler le métabolisme. Les dérivés de phénol intermédiaires, 1 et 3, se sont avérés être étonnamment puissants, offrant de nouvelles possibilités dans la recherche de PPAR &#x003b1 double; agonistes / ligands CB1. Par conséquent, les quatre composés synthétisés peuvent être considérés comme des pistes intéressantes dans la recherche d'une nouvelle classe de ligands doubles capables de moduler le métabolisme avec des activités neuroprotectrices potentielles.